液相色谱仪

9.5%狼毒素母药

质检方法验证

甘肃省农药化肥产品质量监督检疫站

 编制

二零零九年八月

1、          验证内容及技术指标

验证内容及技术指标：外观、新狼毒素A质量分数、pH值（4~7）、干燥减量（%，1.0）、低温稳定性（0±1）℃、热贮稳定性（54±2）

℃。

2、试验方法

2.1 抽样

  按照GB/T1605中“商品原药采样”规定进行。用随机数表法确定抽样的包装件，终采样量应不少于100g。

2.2鉴别试验

  在相同的高效液相色谱（HPLC）操作条件下，试样溶液某一色谱峰保留时间与标准液新狼毒素A色谱峰的保留时间的相对差值应在1.5%以内。

2.3新狼毒素A质量分数测定

2.3.1 方法提要

  采用高效液相色谱外标法，试样以甲醇+水+乙醇为流动相，使用C18不锈钢色谱柱和紫外检测器。对试样新狼毒素A进行高效液相分离及测定。

2.3.2试剂与溶液

  新狼毒素A标品已知含量，≥98%；

   水：新蒸二次蒸馏水

  甲醇：色谱纯

  乙酸：分析纯

2.3.3 仪器

  高效液相色谱仪，具有可变波长紫外检测器；

  色谱数据处理机或色谱工作站；

  色谱柱：150mm×4.6mm(id)不锈钢柱，内装CapcellpakC₁₈MG5mm填充物（或具有相同柱效的其他反相色谱柱）;

过滤器：滤膜孔径约0.45mm；

微量进样器：50ml；

定量进样阀；

超声波清洗器；

2.3.4 色谱操作条件

流动相：体积比y(甲醇+水+乙醇)=60:40:1

流速：0.8ml/min

柱温:室温（温度变化应不大于2℃）；

检测波长：297mm

进样量：20ml

保留时间：新狼素A约6.4min

上述液相色谱操作条件，系典型操作参数。可根据不同仪器特点，对给定的操作参数作适当调整，以期获得效果。

狼毒素A母液液相色谱图

典型的新狼毒素A母药的液相色谱图如上。

2.3.5 测定步骤

a) 新狼毒素A标样溶液的配置

称取新狼毒素A标样0.1g(0.0002g)于50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度、摇匀。用移液管吸取上述溶液5ml，于另一50ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀。再用0.45mm滤膜过滤。

b)新狼毒素A母药剂样的配制

准确称取1g（至0.0002g）于100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度、摇匀。用微孔滤膜0.45mm过滤，取滤液进样20ml。

c)测定

在上述色谱条件下，待仪器工作状态稳定后，先注入数针标样溶液，直至连续两次进样的峰面积（或峰高）相对偏差小于1%，按标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液顺序进行分析。

2.3.6计算

母药新狼毒素A的质量分数（%）按式（1）计算：

式中：

A₁-标样溶液中，新狼毒素A峰面积（或峰高）的平均值；

A₂-试样溶液中，新狼毒素A峰面积（或峰高）的平均值；

P-新狼毒素A标样质量百分数；

m₁-新狼毒素A标样质量，g

m₂-试样质量，g

2.3.7 允许差

  两次平行测定结果不大于1%，取其算术平均值作为测定结果。

2.4 pH值的测定

  按GB/T1601农药pH值的测定方法进行。

2.5 干燥减量的测定

2.5.1仪器设备

  电热恒温真空干燥箱:(95±2)℃;

  真空泵

  称量瓶：内径50mm，高20mm；

  干燥器

2.5.2测量步骤

  将称量瓶入100℃±2℃烘箱中烘1h,取出置于干燥箱中冷却至室温，称量（至0.0002g），重复上述步骤，直至称量瓶恒重为止。在瓶内放置10g试样，铺平，称量（至0.0002g），将称量瓶放入烘箱不加盖，开启真空干燥烘1h，真空度为0.070pa。取出放入干燥器中，称重。

2.5.3 计算

  以质量分数表示的式样加热减量X₂（%）按式（2）计算：

（2）

式中：

   m₃——试样的重量

   m₄——试样和称瓶，g；

m₅——试样和称量瓶烘干后的重量，g.

2.5.4 允许差

  两次平行测定结果之相对偏差应不大于10%。取其算数平均值为测定结果。

2.6 低温稳定性

2.6.1方法提要

  试样在0℃保持1h，记录有无固体和油状物析出，继续在0℃贮存7d，离心，将固体析出物沉降，记录其体积。

2.6.2 仪器

  制冷器：保持（0±2）℃；

  离心管：100ml,管底刻度至0.05ml;

  离心机：与离心管配套。

2.6.3 实验步骤

  取（100±1.0）ml试样加入离心管中，在制冷器中冷却至（0±2）℃，让离心管及其内容物在将离心管放回制冷器，在（0±1）℃继续放置7d。7d后，将离心管取出，在室温（不超过20℃）下静置3h，离心分离15min(管子顶部相对离心力500～600G，G为重力速度)，记录管子底部离析物的体积（至0.05ml）。离析物不超过0.3ml为合格。

2.7 热贮稳定性

2.7.1方法提要

  将试样至于安瓿瓶中，于54℃贮存14d后，对规定项目进行测定。

2.7.2仪器

  恒温箱（或恒温水浴）：（54±2）℃；

  安瓿瓶或（54±2）℃仍能密封的具塞玻璃瓶：50ml；

医用注射器：50ml；

2.7.3 测定步骤

  用注射器将30ml试样，注入洁净的安瓿瓶中（避免试样接触瓶颈），置此安瓿瓶于冰盐浴中制冷，用高温火焰迅速封口（避免溶剂挥发），至少封3瓶。冷却至室温分别称重。将封好的安瓿瓶置于金属容器中，再将金属容器放入（54±2）℃恒温箱（或恒温水浴中），放置14d。取出，冷至室温，将安瓿瓶外面擦拭干净后分别称重，质量未发生变化的试样，于24h内按奔标准2.3规定的方法对有效成分含量进行测定。新狼毒素A相对分解率不大于5.0%为合格。